موتاسیون زایی هدایت شده در توالی تیوردوکسین نوع‎(trx h) h ‎‏ از گیاه برنج و ‏اثرآن بر فعالیت کینتیکی

تیوردوکسین ها (‏trxs‏) پروتئین هایی با وزن مولکولی کم هستند که با توالی آمینواسیدی ‏wc(g/p)pc‏ در جایگاه فعال ‏قابل تشخیص می باشند. ‏trx‏ ها با کمک سیستئین های جایگاه فعال و از طریق احیای برگشت پذیر باند های دی سولفیدی در ‏فرآیند های متعدد اکسیداسیون- احیا شرکت می کنند. برخلاف پستانداران، باکتری ها و قارچ ها، گیاهان دارای ایزوفرم های ‏مختلفی از ‏trx‏ می باشند. ایزوفرم های مختلف ‏trx‏ در گیاهان بر اساس ساختار اولیه و مکان قرارگیری در سلول ‏دسته بندی می شوند. تیوردوکسین های ‏f، ‏m، ‏x‏ و ‏y‏ در کلروپلاست ، ‏trxo‏ در میتوکندری و ایزوفرم های ‏trxh‏ در ‏چندین اندامک سلولی واقع شده اند. در گیاهان عالی ایزوفرم های متعددی از ‏trxh‏ وجود دارند. در ژنوم برنج (‏oryza ‎sativa‏)، نه ژن کدکننده ی ‏trxh‏ شناسایی شده است. همردیف سازی چندگانه بین این ایزوفرم ها، تفاوت قابل توجهی بین ‏ایزوفرم ‏ostrx20‎‏ و هشت ایزوفرم دیگر نشان داد. توالی جایگاه فعال این هشت ایزوفرم از موتیف عمومی جایگاه فعال ‏trxها (‏wcg/ppc‏) تبعیت می کند در حالی که در جایگاه فعال ‏ostrx20‎‏ آمینواسید ‏gly/pro‏ با ‏thr‏ جایگزین ‏شده است. به علاوه در نزدیکی جایگاه فعال، در دیگر ایزوفرم های ‏trxh، آمینواسید حفاظت شده ی ‏asp‏ حضور دارد که ‏در ‏ostrx20‎‏ با آمینواسید بازی ‏lys‏ جایگزین شده است. درتحقیق حاضر، برای مطالعه ی نقش حیاتی آمینواسید های ‏حفاظت شده ی ‏gly‏ و ‏asp‏ در فعالیت احیایی ‏trxh، با استفاده از روش موتاسیون زایی هدایت شده ‏thr55‎‏ و ‏lys48‎‏ به ‏ترتیب با ‏gly‏ و ‏asp‏ در ‏ostrx20‎‏ و ‏gly41‎‏ با ‏thr‏ در ‏ostrx23‎‏ جایگزین شدند. به این منظور و بر اساس این روش ‏واکنش ‏pcr‏ با استفاده از ناقل ‏pet-15b‎‏ حاوی ژن کدکننده ی ‏ostrx20‎‏ طبیعی- به عنوان ماده ی اولیه ی ژنتیکی- ‏انجام شد. محصول ‏pcr‏ بعد از تیمار با آنزیم ‏dpni‏ به باکتری ‏ecoli‏ سویه ی ‏dh5?‏ منتقل شد. بعد از تأیید ‏موتاسیون زایی با استفاده از توالی یابی و هضم آنزیمی به کمک آنزیم برشی مناسب، پلاسمید های حاوی ژن جهش یافته به ‏باکتری ‏e.coli‏ سویه ی ‏rosetta (de3)‎‏ انتقال داده شدند. پروتئین های جهش یافته ی نوترکیب ‏ostrx20(t55g)‎، ‏ostrx20(k48d)‎، ‏ostrx20(t55g)(k48d)‎‏ و ‏his6-ostrx23(g41t)‎‏ پس از القای ‏iptg‏ در فاز محلول تولید شدند. ‏پروتئین های نوترکیب موجود در فاز رویی به روش کروماتوگرافی جذبی و با استفاده از ستون های ‏his-trap‏ ‏خالص سازی شدند. ایزوفرم های ‏trxh‏ جهش یافته ی نوترکیب نیز مانند پروتئین طبیعی از نظر توانایی احیای انسولین- ‏سوبسترای عمومی ‏trx‏ - درphهای مختلف بررسی شدند. به علاوه قابلیت احیای جهش یافته ها توسط ‏osntr1‎‏ ‏آزمایش و با پروتئین طبیعی مقایسه شد. نتایج نشان داد که فعالیت ‏ostrx20(wt)‎‏ در پاسخ به تغییرات ‏ph‏ پایدار نبوده در ‏حالی که جهش یافته های ‏ostrx20(t55g)‎، ‏ostrx20(k48d)‎‏ و ‏ostrx20(t55g)(k48d)‎‏ در برابر این تغییرات پایدار ‏بودند. مطابق با این، جایگزینی ‏gly41‎‏ با ‏thr‏ در ایزوفرم ‏ostrx23‎، منجر به از دست رفتن پایداری ‏ostrx23‎‏ در ‏phهای مختلف شد. به علاوه نتایج نشان داد که جایگزینی ‏thr55‎‏ با ‏gly‏ و ‏lys48‎‏ با ‏asp، تاحدودی باعث بهبود ‏برهم کنش ‏osntr1‎‏ و ‏ostrx20‎‏ شد. بر این اساس برهم کنش ‏osntr1‎‏ و ‏ostrx23‎‏ نیز با جایگزینی ‏gly41‎‏ با ‏thr‏ به مقدار قابل ملاحظه ای کاهش پیدا کرد. به منظور مطالعه ی نقش ‏cysهای انتهای آمینو در ‏ostrx20‎‏ و ‏ostrx23‎، هرکدام از ‏cysها با ‏ser‏ به روش موتاسیون زایی هدایت شده جایگزین شد. نتایج نشان داد درحالی که ‏پروتئین های ‏ostrx20(wt)‎‏ و ‏ostrx23(wt)‎‏ به صورت مخلوطی از فرم مونومر و دایمر حضور دارند، جهش یافته ها ی ‏‎ ‎ostrx20(c3s)(c4s)‎‏ و ‏ostrx23(c11s)‎‏ تنها به فرم مونومر دیده شدند. فعالیت احیایی جهش یافته ها در واکنش با ‏انسولین نیز تقریباً مشابه با پروتئین طبیعی بود. این نتایج نشان می دهد که ‏cys3‎‏ و ‏cys4‎‏ درانتهای آمینوی ‏ostrx20‎‏ و ‏cys11‎‏ درانتهای آمینوی ‏ostrx23‎، نقشی کلیدی در دایمر شدن این پروتئین ها از طریق تشکیل باند های دی سولفیدی ‏دارند.‏